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[怎样去做代母]

ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

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全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

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，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

4.细胞提取液

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贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

悬浮细胞

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

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个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

贴壁细胞

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

悬浮细胞

：离心收集细胞，以2×10

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细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

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细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

中国不孕不育患者约有5,000万人左右，需要进行辅助生殖治疗的患者约占20%，如此庞大的治疗需求与数量有限的医疗资源之间的供求矛盾日渐突出。对于急需通过试管婴儿技术解决生育问题的中产家庭来说，他们愿意为治疗效率进行治疗升级，因此开始转向寻求更先进、更高效的海外试管婴儿治疗。

日本作为亚洲的发达国家，日本试管婴儿技术也是亚洲辅助生殖领域的领航者，与美国同步使用最新的试管婴儿技术，也有自己独到的日本试管婴儿技术，例如适合大龄试管的微刺激促排卵方案、降低卵子损伤的Piezo-ICSI受精方式、提高24%移植成功率的的专利移植技术SEET法。尽管如此，日本试管婴儿费用却不昂贵，性价比高，一个完整的日本试管婴儿周期费用约在10万-12万人民币之间。就算要做日本第三代试管婴儿，费用也是非常灵活，可以根据最终培养的囊胚数量选择单个计费（1.1万人民币/颗）或者套餐计费（6.5万人民币/6-8颗）的方式支付。

其中，备受中产不孕家庭关注的是日本第三代试管婴儿技术，统称PGT，具体分为PGT-A（即PGS）、PGT-M和PGT-SR（后两者都是PGD，诊断家族的特定遗传病）。日本第三代试管婴儿PGT通过筛查胚胎染色体异常问题，帮助超过35岁的高龄女性试管或有反复流产史、多次移植失败的女性，预防家族遗传病、提高着床率、降低流产率等等。

日本第三代试管婴儿PGT采样一般是从囊胚数百个细胞中抽取2-5个细胞进行染色体采样。传统的采样方式，是用吸管直接深入囊胚中采集，有一定损伤核心细胞团的风险。日本最大的生殖中心之一的日本英医院生殖中心YingIVF，则是采用不深入细胞内取样，通过领先业界的初期胚打孔+囊胚采样方式，最大程度地降低胚胎细胞损伤的风险。日本英医院第三代试管婴儿PGT的检测技术，已经升级为国际最先进的NGS（Next Generation Sequece新一代基因测序技术），对于胚胎染色体的评估更为全面，具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点。所以，日本英医院第三代试管婴儿PGT结果不再只是“通过”和“不通过”，也把一些胚胎的“中间地带问题”反映出来：

1、Euploid（整倍体）：推荐移植。胚胎中检测到每组常染色体及性染色体均有两条，试管婴儿移植成功率可在65%左右。

2、Mosaic （嵌合体）：可以尝试移植。胚胎有两种以上的核型细胞组成，即胚胎中同时存在正常与不正常的细胞，试管婴儿移植成功率约在10-30%。

3、Aneuploid（非整倍体）：不建议移植。非整倍体是不合格的胚胎，胚胎存在染色体数量异常，即便移植也不会着床，或者着床之后发生流产。

4、三倍体 (Triploid)：不建议移植。胚胎中的每一对染色体均有三条，这类胚胎移植后通常难以存活。

5、染色体一部分缺失或重复 (Segmental Deletion / Duplication)：根据具体情况而定。胚胎染色体部分片段丢失，或部分片段增加一份或几份，直接咨询医生移植建议。

除了以上结果之外，日本英医院的国际患者还能查看第三代试管婴儿PGT报告中的第23对性染色体结果。

日本英医院生殖中心YingIVF目前每年7,000个试管周期，实施第三代试管婴儿PGT的比例大概在40%左右，建议男方精子DNA碎片率高且质量差、有反复流产史且曾检出胎儿染色体问题、准父母任一方已检出有染色体问题或家族遗传史、大龄备孕而胚胎数量又比较多等等情况的不孕家庭考虑做第三代试管婴儿PGT。如果不属于以上情况，可以不做日本第三代试管婴儿PGT，绝大部分胚胎即使有染色体异常也会在早期自然淘汰，并不会对母体造成伤害。

所以做日本第三代试管婴儿PGT并不要盲从，而是根据自己的情况做个案分析更为可靠。如果需要进行个案咨询，日本英医院生殖中心YingIVF将结合您的个人情况，为您私人定制日本试管婴儿方案。

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